一、拉曼光谱技术在细菌研究方面的主要应用类型

    细菌存在于生活的方方面面，医学、农业、环境、食品、考古等多领域均将其作为重要研究内容之一。拉曼光谱是一种指纹光谱技术，能够快速获取样品的化学结构信息。因此能够被应用于细菌分类、细菌筛选、细菌耐药性、细菌分泌物等研究。

1、细菌分类和细菌筛选

    拉曼对细菌分类很好理解，不同细菌具有不同的细胞结构和成分，拉曼光谱能够区分出细菌组成的化学类型或其含量比例的不同。一般情况下，细菌的结构很类似，肉眼难以直接判断其类型，需要借助化学计量学对其进行分析，即可实现快速细菌分类。相对于传统方法需要培养数天细菌再进行鉴别，此方法效率提高数十倍。

 

                                                            Identification of bacteria in drinking water with Raman spectroscopy，Anal. Methods, 2013

   当我们将各类细菌的拉曼光谱建立成数据库，利用拉曼+光镊+微流控协同体系，即可进行细菌的但单细胞筛选。

                                    Raman-Activated Cell Sorting Based on Dielectrophoretic Single-Cell Trap and Release.nal. Chem. 2015

                                      Label-free, rapid and quantitative phenotyping of stress response in E. colivia ramanome，Scientific RepoRts ,2016

    不同细菌、相同细菌在不同发育时期，其化学结构及其含量比例，由此可延申研究细菌生长发育分期、外部环境诱导细菌分化等各类研究，在此不一一赘述。

2、细菌耐药性

    利用拉曼技术筛选有效药物是目前最成熟和最有效的拉曼-细菌应用类型。通过给细菌饲喂带有氘原的葡萄糖营养液，如果细菌耐药，则氘原子代谢到细菌细胞中，在2200cm-1处出现明显的D-O峰，区别于H-O键，此范围属于俗称的拉曼静默区，能够很灵敏的判别。利用这一技术，不到1小时即能够判断药物对细菌是否有致死作用。

Rapid Antibiotic Susceptibility Testing of Pathogenic Bacteria Using Heavy-Water-Labeled Single-Cell Raman Spectroscopy in Clinical Samples，Anal. Chem. 2019

二、细菌研究对拉曼光谱仪设备有哪些主要要求？

    从上面的内容得知，拉曼研究细菌具有非常好的辨识度，成熟可靠，那么是不是任何一台拉曼都能够用于细菌测量呢？答案是否定的。那么细菌研究对拉曼选择有哪些核心要求呢，我们分析细菌研究的特点后即可豁然开朗。

1、细菌尺寸很小。多数细菌的尺寸在10-100微米范围内，部分细菌可小至2微米升值1微米以下。由此对拉曼的第一需求——小聚焦光斑。因此要求拉曼光谱仪要对激发光束进行整形、同时尽可能选择高倍物镜，以达到将聚焦光斑控制在细菌体积范围内。如下右图为我司研发的DeepBlue系列共聚焦拉曼光谱系统的聚焦光斑实测图像，100倍物镜聚焦光斑<1微米。小的聚焦光斑还具有的另一个优势：即激光功率密度大，拉曼激发效率高，也保证了系统的灵敏度。这也就解释了很难看到手持式或光纤探头拉曼能够对单细胞的细菌进行测试。

                 左图来自于网络，如有侵权请联系作者删除。

2、细菌多数是光学透明的。光学透明意味着拉曼的激发光很容易穿透细菌并照射到细菌的培养皿，则培养皿的拉曼信号容易干扰细菌拉曼测试。这种特点对拉曼光谱仪的Z轴的共聚焦性能也提出了更高的要求。通过减小针孔尺寸压制聚焦光斑以外的拉曼信号，获得高信噪比拉曼光谱数据。

3、细菌体系可能带有荧光。细菌作为生物体会包含荧光特性的氨基酸（如色氨酸等）或其他荧光分泌物，另一方面，培养基材料的类别或纯度也很有可能带入荧光。因此选择合适的激发波长也是非常关键的一环。如果细菌体系无荧光，优选532nm等短波长激发，测试信号强，测试速度也快。如果确有荧光则需要选择785nm或1064nm等长波激发，或针对研究体系选择专门的激发波长，避开荧光干扰（如下示意图）。

                     上图为示意图，不适合所有类型样品，荧光特性由样品本身决定，需要进行单独考察

4、其他因素。拉曼系统的通光效率、杂散光抑制能力，光谱分辨率、探测器温度，光谱测量范围等因素也会影响到细菌测量。其中通光效率+杂散光抑制能力=系统的灵敏度更为重要，直接影响了测试结果是否可用。系统灵敏度另外阐述，此文暂不涉及。

三、DeepBLUE200共聚焦显微拉曼光谱仪细菌样品实测效果

1、样品来源：成都生物所

2、样品种类：大肠杆菌？

3、样品数量：2

4、测试条件：

         注：本次测试设备部件均为国产，光谱仪更换为进口型号，效果更好。

5、样品处理办法和测量过程:

    5.1 用镊子将培养皿中的样品挑取到中空金属支架上，使测试区域悬空；

    5.2 白光反射照明+CCD相机+10X物镜寻找和观察目标细菌；

    5.3 切换至100X物镜，聚焦清晰；

    5.2 点击控制器，白光制动切换至激光光路，激光照射到样品上，开始测量；

6、测试结果

以上获得了清晰的细菌拉曼光谱数据，两种细菌区分有明显的拉曼峰位，达到了用户目标要求。相对用户此前采用本单位拉曼测试结果（如下两图），DeepBlue200的效果非常明显。

                     细菌1（明显的背景信号，无细菌拉曼信号） 

                      细菌2（明显的培养皿塑料拉曼信号，无细菌信号）

四、仪器推荐

DeepBlue200是一款高性能全自动激光共聚焦显微拉曼成像光谱仪，用于固体液体样品的拉曼光谱测量，用于体相材料的拉曼光谱扫描成像。特点如下：

自动化：自动切换白光/激光光路，自动切换激发波长、自动选择激光功率。

高灵敏：真共焦设计，极简光路，高杂散光抑制能力无惧硅三阶峰信噪比挑战，直面激光不耐受和拉曼信号弱等难测样品的考验，如薄膜、小颗粒和稀溶液样品。

稳定性：主要力学结构件和光机部件均采用高强度合金材料，结构力学重心下移光学部件刚性耦合，仪器具有极佳的稳定性，抗环境扰动能力强。

灵活性：DeepBlue200可采用全国产光学部件，为用户提供低成本高性能解决方案，满足大多数用户需求；DeepBlue200也可集成HORIBA高端光谱仪和XYZ扫描平台，实现高光谱分辨率、高空间分辨率和大样本自动分析等高级功能。