由氨基酸组成的蛋白质和多肽是生命科学研究中必涉及的研究对象，作为生命体组成的基本单元之一，其研究深度和广度也是超出很多人的想象。其涉及到生物医学、食品、农业、制药等多领域。当前，很多技术被用于分析蛋白和多肽，如氨基酸分析仪、圆二色光谱仪、拉曼光谱仪、XRD、FTIR、核磁共振、ITC、冷冻电镜、SPR蛋白质相互作用等。拉曼光谱能够快速获取物质的化学结构信息，对于蛋白和多肽研究，拉曼光谱技术有其自身优势，也有明显的局限性，需要根据实际情况来选择。

一、拉曼光谱技术在蛋白多肽分析领域的优势

1、主要优势——指纹光谱技术应用与蛋白多肽二级结构分析

     拉曼对分子化学键非常敏感，因此能够用来分析蛋白多肽的化学结构，包括二级结构。如下图1为蛋白质的典型拉曼光谱曲线，对照如下标记峰位，可以快速读出所测蛋白的各组分组成及其含量。其中1000cm^-1指向了苯丙氨酸，508cm^-1指向S-S键；1600-1700cm^-1为 Amide I带，1200-1400cm^-1 为Amide III带，可计算解析α-helix、β-strand、Random coil等蛋白多肽的二级结构。Amide I带相对于Amide III带光谱更为清晰且容易拟合，因此多数报道采用Amide I带的拟合结果。拉曼光谱在辨析化学结构方面的优势可延伸出很多相关应用，如蛋白质变性（食品加工）、蛋白质相互作用（生命科学）、蛋白质微环境（溶剂效应）等。

       图1. 典型蛋白质指纹区拉曼光谱曲线

                    图2. Amide I带的解析计算蛋白二级结构比例

2、其他优势——无损和快速

    拉曼为光激发散射现象，一般采用532nm、785nm等非紫外光激发，因此对样品基本无损，可适用于蛋白溶液、生物细胞组织等各种体系的直接测量。测试时间一般为秒级，部分样品短只0.1秒，相对于氨基酸分析仪、CD和冷冻电镜等蛋白化学结构分析技术，测试效率非常明显。

    另外，相对于红外光谱，水对拉曼信号的干扰相对较小，因此拉曼光谱允许活体细胞等含蛋白组分的样品分析。

二、拉曼光谱技术在蛋白多肽分析领域的局限性

1、主要局限性——拉曼光谱技术不合适分析低浓度和复杂混合样品

    拉曼散射的效率极低，为10^-6级别，也就是10万个光子照射样品才会出现几个拉曼散射光子信号。因此拉曼光谱技术非常适合分析半导体、碳材料、高分子材料、无机金属氧化物等高纯和高浓度的样品。实际生产中，大部分蛋白在溶液或在生物体中都是微量存在，并且混入了多糖、核酸等其他生物活性物质。采用拉曼技术测量的信号会很弱，需要长积分时间。

    因此，对于蛋白多肽的拉曼测试，提高溶液浓度或选择具有局部高浓度的样品会获得更有利的测试结果。常规来说，蛋白多肽溶液的浓度应该大于1%，最好能达到5%以上，尽量纯化样品有利于准确解析蛋白结构。当然，对于胶原蛋白、生物药这类固体粉末或则高浓度纯蛋白多肽样品，是极好的拉曼测试样品，拉曼信号很强。对于诸如细胞、动物组织等局部蛋白高浓度样品也是非常适合拉曼的，采用高倍物镜将光斑聚焦到微米级，能够获得高分辨率的细胞（组织）蛋白空间成像。如下图细胞拉曼成像，细胞尾巴（蓝色）组成为蛋白，通过拉曼扫描成像能够清晰的辨别各组分的空间分布。  

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2、其他局限性-拉曼成像速度慢

    如上所诉，大多数含蛋白多肽样品（细胞或动物组织）的拉曼信号较弱，拉曼测量时单点积分时间会比较长，如10秒甚至更长。细胞或动物组织本身又精细的结构，需要共聚焦拉曼进行高分辨率扫描，步进甚至要求达到0.5微米，按此计算，扫描1个10微米直径的小型细胞，也需要超过1个小时。对于尺寸达到厘米级动物组织或器官，将是巨量时间，已经无实用价值。为了解决拉曼成像速度慢的问题，科学家研发出了受激拉曼和相干拉曼，拉曼成像速度可提高上万倍。该技术需采用两束飞秒激光器，因此设备极其昂贵，在此提供一张美图，细节不再详述。

三、蛋白多肽样品对拉曼光谱仪设备有哪些主要要求？

（1）仪器的灵敏度

    由以上得知，蛋白多肽拉曼测试的核心问题是信号强度问题，在样品浓度无法提升的情况下，仪器灵敏度越高越有利于该类样品测试。仪器灵敏度由多因素组成，激光功率、激发/收集光学系统效率，探测器效率等。共聚焦拉曼光谱仪一般采用测量单晶硅三阶峰来衡量，将另文介绍。

（2）光谱分辨率

    蛋白多肽由数个至数万个氨基酸组成，内部化学结构非常复杂，因此拉曼光谱的峰位重叠现象非常明显，以上介绍和文献检索都能看到，蛋白多肽的拉曼光谱有大量拉曼峰位相互交叠而成，采用高光谱分辨率拉曼更有利于解析蛋白多肽的化学结构变化。

（3）扫描成像功能

   除非是生物制药企业等测量固定高纯度样品或仅研究液体蛋白多肽样品，一般需要配置扫描成像功能，便于研究生物体不同区域蛋白多肽的结构及其变化。

（4）激发波长选择

    波长选择是拉曼光谱仪器选型的必修课，蛋白多肽存在色氨酸等发光基团，一套用于蛋白多肽测量的拉曼最好能配置2个波长（一般推荐532nm和785nm），以便适用于更多这类样品的分析。

  上图为示意图，不适合所有类型样品，荧光特性由样品本身决定，需要进行单独考察

四、DeepBLUE200共聚焦显微拉曼光谱仪蛋白实测效果

1、样品：多肽溶液

2、样品数量：5

3、测试条件：

4、样品处理办法和测量过程:

4.1 用移液器将多肽溶液滴在中空金属支架上的保险膜上（保鲜膜可用手指按压一下形成凹陷），尽量使液体成半球状，厚度大于3mm；

4.2 使用50X长焦物镜；

4.3 启动拉曼实时采集功能，观察样品拉曼信号，在最强处停止，增加积分时间至10 s，记录每个样品的拉曼光谱 ；

5、测试结果

      多肽溶液全拉曼光谱曲线

     其中2个样品的Amide I带拉曼光谱曲线拟合

    以上获得了清晰的多肽拉曼光谱数据，不同样品拉曼光谱特征明显，达到了用户区分多肽二级结构的要求。

五、仪器推荐

DeepBlue200是一款高性能全自动激光共聚焦显微拉曼成像光谱仪，用于固体液体样品的拉曼光谱测量，用于体相材料的拉曼光谱扫描成像。特点如下：

自动化：自动切换白光/激光光路，自动切换激发波长、自动选择激光功率。

高灵敏：真共焦设计，极简光路，高杂散光抑制能力无惧硅三阶峰信噪比挑战，直面激光不耐受和拉曼信号弱等难测样品的考验，如薄膜、小颗粒和稀溶液样品。

稳定性：主要力学结构件和光机部件均采用高强度合金材料，结构力学重心下移光学部件刚性耦合，仪器具有极佳的稳定性，抗环境扰动能力强。

灵活性：DeepBlue200可采用全国产光学部件，为用户提供低成本高性能解决方案，满足大多数用户需求；DeepBlue200也可集成进口高端光谱仪和XYZ扫描平台，实现高光谱分辨率、高空间分辨率和大样本自动分析等高级功能。